默克突破 | bioPROTAC技术靶向降解RAS蛋白

撰文 | Leon

责编 | 雪月

30%的肿瘤都携带RAS蛋白（H-，N-和K-RAS）的激活突变。在过去的40年研究中，它们曾经被认为是“不可成药的”（undruggable）靶点，直到最近，靶向G12C突变的KRAS共价抑制剂在肺癌治疗中展现出来不错的效果【1，2】（详情请见BioArt报道：Nature 亮点 ：首个 KRAS 抑制剂在临床试验中应用 ）。但是，相比而言，G12V和G12D两种突变类型在癌症中更常见，我们仍然缺少有效靶向它们的办法。

快速发展的PROTAC技术被认为可以抑制“不可被靶向”的蛋白分子，有望成为了抑制KRAS蛋白的利器。PROTAC这种双功能分子的一头结合目标蛋白，另一端结合E3泛素连接酶的组件，从而使两者靠近，介导目标蛋白的多泛素化和降解（详情请见BioArtReports报道：好消息 ， 首次证明 PROTAC 药物安全有效 ）。然而，想要使用PROTAC降解KRAS蛋白，人们还要找到KRAS的高亲和力配体。由于蛋白表面没有明显的结合口袋，想要找到非共价的KRAS配体是非常困难的。另外，鉴定出有效招募E3连接酶的部件也不容易。

为了解决上述的难题，6月27日，默克公司的Anthony Partridge团队在bioRxiv上传了题为bioPROTACs establish RAS as a degradable target and provide novel RAS biology insights的论文，开发出了一系列靶向不同RAS蛋白亚型和招募不同E3连接酶的大分子PROTAC（bioPROTAC），第一次证明RAS蛋白是可被降解的。

首先，作者用绿色荧光蛋白（GFP）作为靶点测试了他们的bioPROTAC平台。简单来说，实验者在HEK293细胞同时表达一系列bioPROTAC融合蛋白和GFP（或GFP-KRAS融合蛋白），然后用流式细胞术和荧光显微镜等手段检测GFP的降解。类似于小分子PROTAC，这些靶向GFP的bioPROTAC融合蛋白主要由两部分组成：E3连接酶的组分和结合GFP的binder。在这项研究中，作者使用了靶向GFP的纳米抗体vhhGFP4【3，4】（图1）。

事实上，并不是所有E3和binder的组合都能达到最佳的降解效果。进一步，研究者从一系列E3连接酶部件中鉴定出能够有效降解RAS蛋白的Speckle-type BTB–POZ protein（SPOP）。接下来，实验人员把SPOP与一系列RAS蛋白的binders融合，开发出几种靶向RAS蛋白的bioPROTAC（图1）。

图1. 靶向GFP和KRAS蛋白的bioPROTAC示意图

K27是选择性结合GDP形式KRAS的蛋白【5】。在胰腺癌细胞株AsPC-1表达K27-SPOP融合蛋白可以诱导KRAS（G12D）的降解，抑制癌细胞增殖，并促进细胞凋亡。K27或者SPOP的关键氨基酸突变都会削弱这个bioPROTAC的活性（图2）。

图2. K27-SPOP抑制KRAS突变的胰腺癌细胞。（左）K27-SPOP抑制细胞的增殖。（右）K27-SPOP诱导细胞凋亡。活化的caspase-3（细胞凋亡的标志物）被染上绿色，DNA被染上蓝色。

这项研究再次证明，RAS蛋白是可以被诱导降解的，大分子的bioPROTAC会是其中一个选择。最近，mRNA体内递送技术的发展为这种大分子候选药物的开发提供了可能【6-10】。如果药物递送的障碍可以被解决，靶向KRAS的bioPROTAC将有可能成为肿瘤治疗新的希望。

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.06.26.174565v1

参考文献

1. Canon, J. et al. The clinical KRAS(G12C) inhibitor AMG 510 drives anti-tumour immunity.Nature575, 217-223, doi:10.1038/s41586-019-1694-1 (2019).

2. Hallin, J. et al. The KRAS(G12C) Inhibitor MRTX849 Provides Insight toward Therapeutic Susceptibility of KRAS-Mutant Cancers in Mouse Models and Patients.Cancer Discov10, 54- 71, doi:10.1158/2159-8290.CD-19-1167 (2020).

3. Saerens, D. et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies.J Mol Biol352, 597-607, doi:10.1016/j.jmb.2005.07.038 (2005).

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