钙既是植物所必需的矿质元素，又是细胞信号物质，在细胞内的分布呈现出复杂的时空动态变化。园艺植物的许多生理病害由Ca2+分布不平衡和代谢失调引起的，如苹果苦痘病、梨褐斑病、番茄脐腐病等，果实品质受损，经济效益下降。在苹果生产过程中，对幼果喷钙、采后浸钙等处理能增强苹果果实硬度，延缓果实衰老软化，延长存储时间，提高果实外观品质，然而也有研究结果表明钙处理对果实品质没有影响，也不能降低苹果苦痘病的发病率。这些研究结果之所以相互矛盾，主要原因是钙能否被果肉细胞吸收及其在细胞中的作用尚不清楚。Ca2+荧光呈像是最直观有效的研究细胞Ca2+的方法。对于不易建立稳定转基因植物，如苹果、梨等果树，采用小分子Ca2+荧光探针装载进入细胞，非常有利于研究细胞中Ca2+的分布和变化，但是小分子荧光探针容易发生‘区室化’现象，降低了他的可靠性。
2020年6月，Horticulture Research在线发表了青岛农业大学研究团队题为Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica的研究论文。该研究开发了精确检测苹果果肉组织细胞质中钙动态变化的新方法。
该研究首次从成熟‘富士’（Malus domestica Borkh. CV. Fuji）苹果果肉组织细胞中通过酶解获取原生质体，在37°C（30 min）下将小分子荧光试剂装载到原生质体中，通过观察荧光显微镜检测果肉组织细胞质中的Ca2+。以目前最常用的Fluo-8/AM、Fluo-4/AM和Rhod-2/AM这3种荧光试剂进行果肉原生质体染色，采用Ca2+通道阻断剂La3+、Ca2+螯合剂EGTA、Ca2+载体A23187和Ionomycin，调节细胞内的Ca2+浓度，检测荧光值的变化。
Protoplasts were obtained by enzymatic hydrolysis.
该研究主要结果如下：（1）经FDA检测，酶解分离出的苹果果肉原生质体具有活性。（2）Fluo-8/AM等化学荧光试剂可以成功染色苹果果肉胞质中的Ca2+，当终浓度为5 μmol/L时荧光强度最强，且无‘区室化’现象。（3）La3+和EGTA处理，在25 min内荧光完全猝灭；A23187和Ionomycin处理原生质体在10 min时荧光强度达到峰值。此外，当La3+降低原生质体的荧光后，A23187可以恢复Ca2+荧光值。
Loading of three kinds of Ca2+ fluorescent dyes into the protoplasts from flesh cells.
总之，Fluo-8/AM等小分子荧光探针可以染色苹果果肉胞质中的Ca2+，不会发生区室化，可以用于检测细胞质中Ca2+的时空变化。该方法可用于园艺植物组织细胞钙的研究。
青岛农业大学园艺学院硕士研究生仇丽娜为本论文第一作者，青岛农业大学园艺学院王永章教授和屈海泳副教授为论文的共同通讯作者。该研究受到国家重点研发计划项目“矮砧苹果高效栽培技术集成研究与示范”的资助。
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