Science细读|专家点评：多种人体肿瘤内首次发现大量细菌，乳腺癌最为丰富

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细菌是在100多年前在人类肿瘤中首次发现的，但由于其生物量低，肿瘤微生物组的表征仍然具有挑战性。

2020年5月29日，Deborah Nejman等人在Science 在线发表题为“ The human tumor microbiome is composed of tumor type–specific intracellular bacteria ”的研究论文，该研究对肿瘤微生物组进行了全面分析，研究了7种癌症类型（包括乳腺癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，黑素瘤癌，骨癌和脑癌）中的1526种肿瘤及其邻近的正常组织。该研究发现每种类型的肿瘤都有独特的微生物组组成，乳腺癌具有特别丰富多样的微生物组。肿瘤内细菌大部分在细胞内，并且存在于癌细胞和免疫细胞中。 该研究还注意特定细菌与肿瘤类型和亚型，吸烟状况和免疫疗法反应之间的关联。

最后，2020年5月29日，Chloe E. Atreya等人在Science 在线发表题为“ Probing the tumor micro(b)environment ”的点评文章，该文章系统总结了研究成果，指出细胞内细菌病原体具有复杂的机制来操纵宿主细胞途径；有趣的是，驻留肿瘤的细菌是否编码相似的效应子，从而使其得以生存和传播。对肿瘤微环境的全面了解是迈向全生物癌症发展机制模型的艰巨而关键的一步，并且如果成功的话，可能会开启下一波精确的癌症诊断和治疗方法。

全球超过16％的癌症发病率归因于传染原。已有多种类型的肿瘤报告了瘤内细菌，但尚未对这些细菌进行全面表征。肠道微生物组已显示对肿瘤生物学有多种影响，例如转化过程，肿瘤进展以及对包括免疫疗法在内的抗癌疗法的反应。因此，表征肿瘤微生物组可能是揭示肿瘤细菌对不同癌症标志的影响的重要步骤。

由于肿瘤微生物组的生物量相对较低，细菌或细菌DNA对肿瘤样品的污染可能会成为问题。因此，至关重要的是要采取多种措施来避免或至少检测出在对肿瘤微生物组，进行分析的过程中的任何可能的污染。 为了表征和可视化肿瘤内细菌，研究人员对大量的实体人类肿瘤样品应用了多种方法的组合，以检测细菌DNA，RNA和细菌外膜或细胞壁成分。

为了表征和可视化肿瘤内细菌，研究者对大量的实体人类肿瘤样品应用了多种方法的组合，以检测细菌DNA、RNA和细菌外膜或细胞壁成分。集中研究了黑色素瘤、骨骼和脑瘤等七种常见的实体瘤类型，共分析了1010个肿瘤样品和516个正常样品，包括来自同一患者的正常相邻组织（NAT）。研究发现， 不同的癌症类型在细菌DNA阳性肿瘤的比例上存在差异，其中黑色素瘤占14.3%，乳腺、胰腺和骨肿瘤占到60% 。此外，在与外界环境无直接联系的实体肿瘤如卵巢癌、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、骨癌中也检测到了细菌DNA。

为了进一步验证人类肿瘤中是否存在细菌，研究者对另外400个肿瘤（与上述的152个样本无关）进行了染色，以确定是否存在细菌。 通过使用针对细菌脂多糖（LPS）和脂磷壁酸（LTA）的抗体进行免疫组化（IHC），分别检测革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。另外，还使用RNA荧光原位杂交（FISH），以及针对细菌16S核糖体RNA（rRNA）的通用探针，来检测这些肿瘤中的细菌RNA。为了控制非特异性染色，还将IHC阴性对照（无一抗）和FISH阴性对照（非特异性补体探针）应用于样品。结果发现，在所有肿瘤类型中都检测到细菌LPS和16S rRNA，并显示出相似的空间分布。而LTA主要在黑色素瘤中检测到，在其他肿瘤类型中则基本上不存在。

细菌在各种肿瘤组织中的出现的情况（图源自Science ）

肿瘤核心的病理检查表明，LPS和细菌16S rRNA主要位于癌细胞和免疫细胞中。 在癌细胞中，细菌16S rRNA主要在细胞质中被检测到，而LPS染色与细胞质和细胞核均相关。 通过苏木精和曙红（H＆E）染色检测并通过CD68的免疫荧光（IF）验证，LTA阳性细菌几乎仅在巨噬细胞中发现。

尽管在CD45 + / CD68 +细胞中细菌LPS和LTA染色的强度非常强，但是通过FISH在巨噬细胞中却很少发现细菌16S rRNA。 这种差异可能反映巨噬细胞摄入细菌成分而不是活细菌，或者可能是由于巨噬细胞吞噬并处理了细菌很长时间后，LPS和LTA在巨噬细胞中的积累所致。因此，在细菌被摄入和处理后的几个月内，脂多糖就会在这些细胞中被发现。

此外，研究者还发现，乳腺肿瘤比所有其他类型的肿瘤具有更丰富更多样化的微生物组结构，在所有单个乳腺肿瘤样品中平均检出16.4种细菌，而在所有其他肿瘤类型中检出的平均值＜9。为了确定人类肿瘤中是否存在活细菌，研究者从接受乳房手术的五名妇女那里收集了新鲜的乳腺肿瘤样本。将所有组织在无菌条件下轻轻解离，铺在35种琼脂生长培养基上，并在有氧和厌氧条件下孵育。与这些肿瘤对LPS和16S rRNA FISH的阳性染色相一致，每个肿瘤从四个肿瘤中生长出超过1000个菌落，而从一个肿瘤中生长出37个菌落。 对来自所有五个肿瘤的474个代表性菌落的全基因组测序，发现了37种不同的细菌。

在物种水平上，肿瘤类型独特的微生物组组成也很明显。 最普遍的肿瘤内细菌物种（n = 137种）的聚类分析表明，这些物种中的许多在某些肿瘤类型中富集。研究者观察到了跨相同肿瘤类型的亚型的独特微生物组。例如，当根据雌激素受体（ER），孕激素受体（PR）和HER2的状态比较乳腺癌的不同亚型时，研究者发现了多种细菌分类群，其患病率在亚型之间不同。

最后，尽管不同肿瘤类型的总体微生物组成与其NAT微生物组相对相似，但研究者还检测到了在肿瘤及其NAT中具有不同患病率的细菌。与研究者的观察一致， 即乳腺肿瘤的细菌载量和丰度高于乳腺NAT中的细菌载量和丰度，研究者发现与乳腺NAT相比，许多细菌显著富集于乳腺肿瘤中。

研究人员还发现肿瘤内细菌编码的代谢功能与某些肿瘤亚型的临床特征有关。 一些特定于肿瘤类型的细菌途径富集，可以降解已知在这些相同肿瘤类型中富集的代谢产物。例如，具有可降解肺部肿瘤中香烟烟雾代谢物的细菌富集可能表明，这些代谢物的高含量为可使用这些代谢物的细菌创造了一个理想的生态位。为了证实这一假设 ，研究者比较了100名目前吸烟者的非小细胞肺癌（NSCLC）和43名从未吸烟者（从未吸烟者）的非小细胞肺癌中的细菌功能。 发现，在当前吸烟者的肿瘤中显着丰富的49种MetaCyc途径中的17种是降解香烟烟雾中发现的化学物质（如尼古丁，邻氨基苯甲酸酯，甲苯和苯酚）的途径。因而推测卷烟烟草中存在一些植物相关细菌或其DNA，从而使吸烟者的肺部肿瘤富集。

综上所述，该研究的数据尚未确定肿瘤内细菌是否在癌症的发展中起因果作用，或者它们的存在是否仅反映了已建立肿瘤的感染。不过，随着肿瘤的发展，它们杂乱无章的、渗漏的脉管系统可能允许细菌进入，而免疫抑制的环境可能为其提供了庇护。NAT中也可能存在肿瘤内细菌，这可以解释在肿瘤微生物组及其NAT微生物组之间发现的高度相似性。

启发与问题

1.这些结果提出了多个重要问题，以供将来研究。例如，尽管微生物群的定义特征仍然存在，但是广泛的微生物-微生物和宿主-微生物相互作用，以及这些细菌细胞的多样性和生理状态是否足以构成“微生物群”？

2. 在人类细胞中发现的驻留肿瘤的细菌是否能够相互交流？ 先前的研究表明，肿瘤中发现的细菌可以代谢药物。然而，尚不清楚肿瘤细菌的总体生存力和代谢活性。

3.不管细菌是否在肿瘤发生中起因果作用，进一步的研究还可以集中到肿瘤内细菌可能对癌细胞的不同表型以及对免疫系统及其与肿瘤细胞的相互作用的影响的。正如之前已有研究证明操纵肠道微生物组会影响肿瘤对免疫检查点封锁疗法的反应一样，研究者推测操纵肿瘤微生物组也可能会影响肿瘤免疫力和对免疫疗法的反应。因此，更好地理解这些作用可能为癌症患者的新治疗选择铺平道路。

参考消息：

DOI: 10.1126/science.aay9189

DOI: 10.1126/science.abc1464