两篇 Nature 同发: 严景华、高福、张林琦等团队分别取得新冠人源单克隆抗体新突破

随着新冠病毒在全世界持续蔓延，相关治疗性药物的研发近期接连爆出重磅消息。

2020 年 5 月 26 日，中国科学院微生物研究所严景华团队、高福团队、王奇慧团队联合中科院武汉病毒所袁志明研究员、解放军总医院王福生院士等在Nature在线发表题为 A human neutralizing antibody targets the receptor binding site of SARS-CoV-2 的研究论文。

深圳第三人民医院，南方科技大学，清华大学，广州医科大学等多机构强力合作，张政，王新泉及张林琦共同通讯在Nature在线发表题为 Human neutralizing antibodies elicited by SAR-CoV-2 infection 的研究论文。

其中，严景华团队的研究是首次在非人灵长类动物（恒河猴）试验模型中报告了能有效治疗和预防新冠病毒感染的特异性、全人源单克隆抗体。张林琦团队是首个报道从 SARS-CoV-2 感染患者体内分离到抗体。

图片来源于 Nature

严景华等团队报道在非人灵长类模型中能治疗和预防新冠的人源中和性抗体

在严景华等人的研究中，研究人员利用新冠病毒 S 蛋白重组 RBD 作为诱饵，从 COVID-19 恢复期患者外周血单核细胞（PBMCs）中筛选出特异性记忆 B 细胞。再从单个 B 细胞中克隆获得 IgG 抗体可变区序列，并克隆到含有恒定区域的载体中转染细胞，产生出一系列 IgG 抗体。体外实验发现，两种名为 CA1 和 CB6 的单克隆抗体能够阻断可溶性 SARS-CoV-2-RBD 与 HEK293T 细胞表达的 hACE2 受体的结合。

使用流式细胞术 （FACS） 对 CA1 和 CB6 的结合分析显示，两种单克隆抗体均可特异性结合转染 HEK293T 细胞的 SARS-CoV-2 S 蛋白，转染 SARS-CoV S 蛋白或 MERS-CoV S 蛋白的细胞却不能结合。另外，采用表面等离子体共振法 （SPR） 用 SARS-CoV-2-RBD 测定CA1 和 CB6 的平衡常数（Kd） 分别为 4.68±1.64 nM 和 2.49±1.65 nM。

利用体外表达 SARS-CoV-2 S 蛋白抗原的假病毒，研究 CA1 和 CB6 的中和能力时发现。CA1 和 CB6 均可抑制假病毒转导至 Huh7、Calu-3 和 HEK293T 细胞。与 CA1 相比，CB6 对 SARS-CoV-2 感染 Vero E6 细胞具有更强的中和活性，其 50% 中和剂量（ND50） 为 0.036±0.007 μg/mL，而 CA1 则为 0.38 μg/mL。证明 CB6 的中和活性优于 CA1。

在恒河猴 SARS-CoV-2 感染模型中，鉴于此前观察到 SARS-CoV 的抗体依赖性增强 (ADE) 效应，研究人员在 CB6 的 Fc 部分引入 LALA 突变（CB6-LALA），以降低 Fc 介导的急性肺损伤风险。然后在治疗组 3 只动物中，使用 1×105 半数组织培养感染量 (TCID50) 感染 SARS-CoV-2。CB6-LALA (50 mg/kg) 于感染后第 1 和 3 天进行腹腔注射。对照组 (n=3) 在同样时间注射等量磷酸盐缓冲液 (PBS) 。并每日检测咽拭子病毒滴度，直至感染后 7 天。

结果显示，在对照组中，病毒载量在第 4 天达到峰值，然后自然下降。而 CB6-LALA 可在给药后立即降低病毒滴度。另外，在预防组 3 只动物中，单剂量 CB6-LALA 可显著保护动物不受 SARS-CoV-2 感染。本组喉部拭子检测到了最低水平的病毒载量。

每组恒河猴的尸检报告也显示，经预防性或感染后治疗的猴子表现出有限的病理性肺损伤。与对照组相比，治疗组和预防组肺泡结构整体完整，水肿减轻，未形成透明膜，纤维化明显减少，白细胞浸润明显减少，也没有观察到严重的小支气管和肺毛细血管病变。证明 CB6-LALA 抗体对 SARS-CoV-2 感染具有较强的预防保护作用，并减少感染相关的肺损伤。

进一步的结构研究表明，CB6 识别了一个表位，该表位与 SARS-CoV-2 RBD 中的 ACE2 结合位点重叠，从而通过空间位阻和直接界面残留竞争干扰病毒 / 受体的相互作用。

张林琦团队首次报道从 SARS-CoV-2 感染患者体内分离到中和抗体

在张林琦等人的研究中，研究人员收集了深圳 8 例 SARS-CoV-2 患者的血样，并由患者编号和 A、B 或 C 命名。通过在酶联免疫吸附试验 (ELISA) 平板上连续稀释血浆定量分析抗体结合活性，在平板上涂有来自 SARS-CoV-2、SARS-CoV 和 MERS-CoV 的三聚体 S 蛋白、重组 RBD 或者来自 SARS-CoV-2 的重组核蛋白 (NP) 。使用抗人 IgG 抗体在 450nm 光密度 (OD) 下观察抗体的结合活性。

结果显示，在 SARS-CoV 和 MERS-CoV RBDs 之间虽然没有检测到交叉反应，但对于 SARS-CoV 和 MERS-CoV 三聚体 S 蛋白，ELISA 检测到较强的交叉反应性。除了来自 P#4A 的样品外，其他所有样品均显示与 SARS-CoV 三聚体 S 蛋白交叉结合，而只有 P#1、P#2 和 P#4B 样品识别出 MERS-CoV S 蛋白。这些结果表明 SARS-CoV-2、SARS-CoV 和 MERS-CoV RBDs 在免疫上是不同的，而 RBD 以外的区域可能有助于观察到 SARS-CoV 和 MERS-CoV S 蛋白的交叉反应性。

研究人员接着使用流式细胞术分离识别荧光 RBD 探针的 B 细胞，并分离出 206 例 SARS-CoV-2 RBD 特异性抗体，且 RBD 结合活性差异显著。生物信息学和生物学特性表明，这些抗体来源于广泛且多样的重链和轻链家族。

由于P#2 样本病人体内有大量的 RBD 结合抗体，研究人员也对这些抗体进行了更详细的表征。研究人员在 69 个 P#2 抗体中选择了 13 个，基于它们的系统发育表现和分布，以 5 个 P#1A 抗体克隆作为对照。通过表面等离子体共振获得了 SARS-CoV-2 RBD 的解离常数 （Kd） 。对于 P#2 抗体，Kd 范围为 1.38~21.29nm，而 P#1 抗体范围为 8.48 ~ 260.50 nM 或无法检测。一些重链和轻链基因 （P2A-1A10、P2B-2G4、P2C-1A3、P2C-1E1） 均为 0% 差异的种系克隆，其 Kd 值为 2.47 ~ 21.29 nM。

研究人员测量了这些抗体与 ACE2 的竞争性结合，并将其量化为 ACE2 和 RBD 结合的减少。发现最具竞争力的抗体包括 P2C-1F11、P2B-2F6、P2C-1A3 和 P2A-1A10。但许多 Kd 值很小的抗体却与 ACE2 的竞争最少，这表明结合亲和力并不能预测到与 ACE2 的竞争能力。另外，在含有 SARS-CoV-2 S 蛋白的假病毒实验中，这些抗体中和差异也很大，其 IC50 数值范围为 0.03 至 >50μg/ml。其中 P2C-1F11、P2B-2F6 和 P2C-1A3 的中和活性最大，其 IC50 分别为 0.03、0.05 和 0.62 μg/ml。

研究人员还使用聚焦还原中和试验 (FRNT) 选择了排名前 7 位的假病毒中和抗体来测量对 SARS-CoV-2 的抑制作用。与前面的实验一致，P2C-1F11、P2B-2F6 和 P2C-1A3 是最强有力的中和抗体。然后，研究人员用表面等离子体共振对这些抗体进行配对分析，确定这些抗体是否竞争类似的表位。发现 P2C-1A3 的竞争力最强，P2C-1F11 的竞争力较弱。而 P2B-2F6 是另一种有效的中和剂，与所有测试的抗体相比具有广泛的竞争力。这些结果表明这些抗体既能识别重叠的抗原决定基，也能识别不同的抗原决定基。

最后，研究人员获得了 P2B-2F6 Fab 和 SARS-CoV-2 RBD 复合物在 2.85 埃分辨率下的晶体结构。发现 P2B-2F6 主要使用重链与 RBD 进行相互作用。结构叠加的 RBD/P2B-2F6 和 RBD/ACE2 晶体结构表明，P2B-2F6 与 ACE2 竞争性结合 RBD，且 P2B-2F6 和 RBD 结合亲和力 (5.14nm) ，与 ACE2 和 RBD 结合亲和力 (4.70nm) 相当。

杂志发表论文： A noncompeting pair of human neutralizing antibodies block COVID-19 virus binding to its receptor ACE2 。报告了从一名康复患者中分离出的人源单克隆抗体，能有效阻断新冠病毒与细胞受体 ACE2 结合，显示出强大的中和能力。

以及 5 月 18 日，北京大学北京未来基因诊断高精尖创新中心谢晓亮团队联合多家单位在Cell杂志发文： Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients’ B cells 。利用高通量单细胞 RNA 和 VDJ 测序技术，从恢复期患者的 B 细胞中快速鉴定出新冠病毒中和单克隆抗体。在 hACE2 转基因小鼠的感染实验中，证实该抗体较强的治疗和预防效果。

以上4项研究成果，中国科研团队在中和抗体研究领域两周内上演「大四喜」！

5 月 26 日Nature发表的两篇文章结尾都提到了一个SARS-CoV 特异性抗体 CR3022。1 月 28 日，复旦大学应天雷团队在bioRxiv在线发表一篇研究论文 （后正式发表在Emerg. Microbes Infect） ，首次报告了 SARS-CoV 特异性人类单克隆抗体 CR3022 可以与 SARS-CoV-2 的 RBD 结合。当时也认为CR3022 很有潜力被单独或与其他抗体协同作为候疗法，用于预防和治疗新冠肺炎。

图片来源于 Emerg. Microbes Infect

之后 4 月 3 日，来自 Scripps 研究所的 Meng Yuan 等在Science杂志发表论文： A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV ，揭示了CR3022 抗体与冠状病毒 S 蛋白 RBD 的隐藏表位结合的结构基础。但研究发现，该抗体在体外实验中不能中和 SARS-CoV-2。

关于是否能使用 SARS-CoV 特异性中和抗体来治疗 SARS-CoV-2 感染患者，目前还没有更多的动物实验和临床试验来证明其安全性和有效性。不过对 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的抗体交叉反应性研究显示，两者病毒的 RBD 表位存在高度保守的区域，类似于 CR3022 的这类抗体能够与两种病毒都能发生结合。因此，我们也可以根据这些高度保守的表位去研发通用性疫苗，预防大部分的冠状病毒感染。

相信随着研究的深入，基于结构生物学的结构解析可以给我们更多的结构和抗原表位信息，帮助我们最终成功研发出通用型的疫苗，从而保护人类免遭冠状病毒感染。

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1, Ju, B. et al. Human neutralizing antibodies elicited by SARS-CoV-2 infection. Nature https://doi. org/10.1038/s41586-020-2380-z (2020).

2, Shi, R. et al. A human neutralizing antibody targets the receptor binding site of SARS-CoV-2. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-020-2381-y (2020).

3, Y. Wu et al., Science 10.1126/science.abc2241 (2020).

4, Yuan, M., et al., Science. A highly conserved cryptic epitope in the receptor-binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV. (2020).

5, Jiang, S., Hillyer, C., and Du, L. (2020). Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 and Other Human Coronaviruses. Trends in Immunology.

6, Cao, Y. et al. Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients’ B cells, Cell (2020)

7, Xiaolong Tian et al. Potent binding of 2019 novel coronavirus spike protein by a SARS coronavirus-specific human monoclonal antibody. Emerg. Microbes Infect. (2020)

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