特别关注 | Cell三篇文章揭示G3BP为核心的RNA-蛋白分子机制

撰文 | 图南

责编 | 兮

真核生物细胞的一个主要特征是通过细胞的区域化（cellular compartmentalization）来调节细胞内行使各种基础生命活动的化学过程，进而提高特异性及其效率，主要包括有膜细胞器（membrane bound）和无膜细胞器（membraneless organelles）两大类。已知的无膜细胞器中除了部分（signalsomes）参与细胞信号传导之外，大部分介导的是RNA的代谢并维持其稳态，也被称为RNA 颗粒（RNP granules），广泛分布于细胞核（核仁，Cajal小体，PML小体）以及细胞质内（如 p body, stress granule, 神经内的RNA转运颗粒等 ）。

2009年Clifford P. Brangwynne等人在首次将相分离的概念应用到生物系统，来解释线虫发育中P颗粒的不对称部分。随后的研究认为，RNP颗粒的形成是一个RNA和RNA结合蛋白（RBP）液-液性分离（liquid-liquid phase separation）的过程，起初均匀分布的RNA-蛋白溶液发生相分离形成RNA-蛋白浓度较高的聚集相（condensed phase）以及之外的可溶相（soluble phase）。在聚集相之中，RNA和RBP高度浓缩，表现出液滴（liquid-like）的性质，类似于一个独立的细胞器。无膜细胞器的组分往往存在浓缩相与可溶相之间的分子动态平衡（dynamic equilibrium）。不同聚集体组分各不相同，但他们的核心组成蛋白在结构上都很相似，包括结构化的寡聚结构域(Oligomerization)、固有的无序区（Intrinsically disorder region, IDR）和底物结合区(substrate binding domain, SBD)。以应激颗粒SG（Stress Granules）为例，细胞在是当细胞受到各种环境和内在胁迫（stress）条件下，多聚核糖体解聚并释放大量的mRNA，进而形成大量的无膜RNA-蛋白质聚集体，即应激颗粒。应激颗粒的一个核心组分是G3BP蛋白，由二聚化结构域NTF2、两个无序区（IDR1/2）及RNA结合域（RRM/RGG）构成。

然而，单一核心蛋白的相变和RNP颗粒的形成之间的关系并不清楚。此外，每一类聚集体都有自己的特异性，包括分子组成、物理特性、表面张力等的各不不同，其各自形成及如何共存的调控机制也都尚待研究。

2020年4月16日，Cell杂志背靠背发表的三篇文章以G3BP调控应激颗粒SG形成为例，解析了核心蛋白的相变如何调控RNP聚集体的形成，并且提出了竞争性结合的蛋白互作网络以解释多种聚集体形成及共存的新模型。

第一篇文章来自St. Jude Children’s Research Hospital的J. Paul Taylor组，题目为G3BP1 Is a Tunable Switch that Triggers Phase Separation to Assemble Stress Granules。杨培国博士等人首次在全基因组范围内筛选出了调控SG形成的重要蛋白组分，系统的研究了参与SG形成的蛋白网络以及重要组分在其形成中的作用。该研究发现SG的形成起始于一个包括G3BP1蛋白在内的核心SG网络，该网络由蛋白-蛋白、蛋白-RNA、RNA-RNA相互作用交织而成。当相互协同作用（cooperative interactions）发生的时候，G3BP1复合体诱导相分离的发生从而组装成应激颗粒（SG）。

首先，他们通过对人类全基因组21,121个基因的RNAi筛选，鉴定了210个影响SG组装的蛋白，通过与之前Roy Parker小组发表的SG组成成分以及相关数据库的比对，发现了一个含有36个蛋白的核心SG网络。该网络中G3BP1/2占据核心位置。进一步采用CRISPR/Cas9系统对这36个蛋白逐一敲除发现，只有G3BP1/2双敲之后能够能够完全抑制SG的形成，进一步证明了G3BP1/2的重要性。鉴于G3BP1和G3BP2的高度相似性，他们以G3BP1为例，通过体外实验检测其相变的调控机制，发现G3BP1本身在生理盐浓度下并不发生相分离，而RNA可以促进其相分离。mRNA以及单链RNA可以促进G3BP1相分离，而tRNA或者双链RNA并不能。RNA的长度也起到作用，小于250nt的RNA基本不再促进相分离。

随后，他们通过构建蛋白截短体（Truncation）的方式鉴定出G3BP1的N-端NTF2结构域和C-端RNA结合区域（RBD）分别是SG和相分离所必须的，中间的非折叠区域（IDR）反而是不必须的，与之前一直以来认为IDR主要参与了相分离不同。同时，他们通过RBD互换（swap）的方法探讨了RNA结合价位、结合位点和结合力（affinity）的的问题，发现多价位的RNA结合（2xKH/3xKH）是必须的（multivalency），而且G3BP1的RBD可以被具有该属性的其他RBD所替换来组装SG。而将G3BP的NTF2结构域替换成其他的二聚体结构域发现，GST以及FKBP(F36M)等二聚体也可以行使类似的功能，但是其组装SG的能力不同，说明NTF2结构域可能通过与其他SG蛋白组分（如Caprin1）相互作用进而调控G3BP1的相分离。Caprin1是G3BP1核心网络的成员之一，对SG的形成是非必须的。而Caprin1可以大大的促进G3BP1的相分离。在细胞内过表达Caprin1可以降低细胞形成SG所需的G3BP的阈值浓度（threshold concentration）。

最后，他们研究了中间IDR域对于SG形成的调控功能。虽然IDR对于SG的形成不是必不可少的，但是该研究发现IDR可以调节G3BP1在细胞的可溶性（solubility），缺失IDR的G3BP1组装的SG在FRAP实验中恢复更慢；通过共聚焦显微镜定量SG组分的分离系数（partition coefficient）以及APEX2介导的proximity labeling都显示IDR可以调控部分蛋白被募集到SG的能力。G3BP1含有酸性IDR1区域，缺失实验分析表明其具有抑制SG形成的能力，且这种能力与氨基酸序列无关。E-Q的突变体表明电荷性质决定了这种抑制功能。此外，已有的研究就G3BP1的磷酸化对 SG组装过程的影响尚存在争议，本研究中发现G3BP1 S149磷酸化的mimetic（S149E）极大的降低了其相分离的能力。S149E仍旧能在细胞内组装SG，但是所需的阈值浓度大大提高，证明G3BP1的S149位的磷酸化在一定程度上调控了SG的组装过程。

杨培国博士等人的研究揭示了以G3BP蛋白为核心蛋白互作网络及其介导的的SG组装的分子机制。更为重要的是，他们通过扎实的生化实验解析了G3BP蛋白各个结构与在其相变及SG组装过程中的调控功能，发现IDR之间能够发生分子内以及分子间的相互作用，而RNA的结合和S149位的磷酸化可以调节这三者之间的相互作用，从而起到像开关一样的机制来调节相分离和SG组装。

第二篇文章来自Clifford P. Brangwynne博士课题组，题目为Competing Protein-RNA Interaction Networks Control Multiphase Intracellular Organization。David W. Sanders博士等人同样研究了G3BP蛋白介导的SG组装分子机制，并且分析了不同G3BP蛋白不同结构域对SG组装的影响，得到了很类似的结论，即NTF2结构域和RBD结构域是必不可少的，而IDR1/2的双缺失的G3BP依旧可以介导SG的组装过程，但是单独缺失IDR2结构域的G3BP蛋白失去介导SG组装的功能。同时，他们也发现了蛋白质的多价位结合对于SG的组装至关重要。

不一样的是，David W. Sanders博士等人的研究除了分析G3BP蛋白之外，还借助于他们组之前发表的Corelets系统详尽地研究了与G3BP蛋白互作的其他蛋白在SG组装过程中的功能。该系统主要分为两个部分，第一部分中的iLID可以在蓝光下与第二部分的SspB结合，而FTH1则可以自组装成为24寡聚体。GFP与mCherry可以作为报告系统。

通过构建带有mcherry的NTF2-Corelet同时过表达带有GFP的SG及P小体蛋白组分，发现共有8个蛋白聚集在NTF2的聚集体中，而免疫共沉淀实验（IP）则鉴定出其中三个蛋白与NTF2具有很强的亲和性，包括USP10/CAPRIN1/UBAP2L。G3BP的S38F突变体（不能与CAPRIN1/UBAP2L相互作用）不能形成聚集体，而F33W（不能与CAPRIN1/USP10相互作用）则没有显著影响，说明G3BP与UBAP2L的相互作用对其相变具有决定性作用。与其他两个蛋白不一样的是，USP10并不具有RNA结合域，因此不能提供多价的结合位点。他们发现USP10与NTF2的相互作用会掩盖其结合价位（Valence capping），而非影响其二聚化，进而负调控SG的组装过程。

与第一篇文章类似，他们也发现了高价的RBD与多聚体释放的RNA流（RNA influx）对于SG的形成至关重要。此外，他们还同时分析了P小体的标志物，并且发现在应激条件下，SG常与P小体具有共定位效应，说明不同的聚集体之间的共存与相互调节关系。而在G3BP双敲除的细胞系中过表达UBAP2L或者FXR1都能够恢复SG的组装过程，说明他们可以独立于G3BP蛋白而形成自己的组装节点（Node）。而UBAP2L能够与G3BP和FXR1结合，但是不能同时结合两者，提示G3BP和FXR1竞争性地结合UBAP2L。细胞中G3BP/FXR1的比例过高则可能抑制SG形成，而在G3BP双敲细胞中过表达UBAP2L得到的聚集体中既有SG的标志物，也有P小体的标志物。因此，他们构建了一个同时涉及SG和P小体组装的蛋白互作网络，并且认为蛋白之间的竞争性结合对于多相共存（multiphase co-existence）至关重要。实验结果也证实同时过表达远端的蛋白组分（亲SG的G3BP与亲P小体的DCP1A）能够促使两者分开。

总之，该研究不仅解析了G3BP蛋白各结构域在SG形成中的关键功能，还通过蛋白互作网络提出了相分离及多相共存的新的模型。他们认为正常情况下，不同聚集体（如SG/P小体）之间各自存在组装节点，且共享的蛋白组分可以作为连接的桥梁，是两者共存且存在一定的共定位效应。而引入饱和的帽盖蛋白（cap protein）来封闭连接两组分之间的桥梁会促使两个聚集体分离。然而，如果帽盖蛋白封闭了其中某组分的组装节点或者清除其底物（如RNA）则会直接抑制该聚集体的形成，而使另一聚集体单独存在。

第三篇文章来自Titus M. Franzmann博士课题组，题目为RNA-Induced Conformational Switching and Clustering of G3BP Drive Stress Granule Assembly by Condensation。该研究主要采用了一系列生化实验对G3BP进行研究，同样发现了其各结构域功能。与第一篇文章类似，他们也发现了IDR区域可以通过变构效应来抑制G3BP蛋白功能，进而抑制SG的组装过程。此处就不再做详细介绍。

总之，这三篇文章通过不同的实验手段，从不同角度共同阐述了G3BP调节SG形成的分子机制，揭示了单一蛋白的相变如何调控多组分RNP聚集体的形成，对于细胞内其他的无膜细胞器的形成具有重大启示意义。同时，这些研究也为各无膜细胞器之间的共存及互相调控提供了新的模型及研究思路。

另外，这也是继2018年Cell（Volume 173 Issue 3）同时报道4篇相分离相关的文章后（详见BioArt报道：李丕龙教授特评丨生物大分子的“相变”——简谈近期系列“相变”研究成果），再一次同时报道了3篇相分离的文章。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.046

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.050

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.049

制版人：嘉