张锋发布新冠病毒的CRISPR检测详细操作方法，并免费提供试剂盒

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2月14日，CRISPR基因编辑大神张锋教授团队发布了使用基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技术检测新型冠状病毒的详细操作流程文档。

测试表明，SHERLOCK技术检测新冠病毒异常灵敏，每微升里仅10-100个病毒拷贝，都可以被检测出来。而且，该方法操作简单，仅需纯化的核酸分子样本，通过简单的三步，1个小时内即可完成检测。

此外，张锋强调，由于他们无法获取新型冠状病毒患者样本，因此无法使用真实的患者样本来验证这一技术。同时，他们欢迎有新型冠状病毒肺炎（COVID-19）样本的研究人员联系，可以免费提供用于检测的试剂盒。

张锋表示，希望该protocol可以为有兴趣进一步开发该诊断系统的研究人员提供参考，也欢迎研究人员与之联系以寻求帮助或指导。

SHERLOCK技术由张锋团队于2017年发明，此后在拉沙热、埃博拉、寨卡病毒、登革热等RNA病毒疫情检测中大显身手。

Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶，专一的切割RNA，不切割DNA。世界上许多最常见或致命的人类病原体都是RNA病毒（例如埃博拉病毒、艾滋病病毒，流感病毒、SARS病毒等）此次在武汉爆发的新型冠状病毒，同样是RNA病毒。

张锋团队，针对此次新型冠状病毒，设计了两个向导RNA（gRNA）,分别用于识别新冠病毒的S基因和Orf1ab基因。

为最大化提高检测特异性和准确率，设计的向导RNA以最大程度减少对人类呼吸系统相关病毒的脱靶性。

这样，一旦检测样本中含有新型冠状病毒，向导RNA就会识别到它的S基因和Orf1ab基因，进而引导Cas13切割这两个病毒基因。通过让被切割的RNA形成条带，形成视觉可见的结果，清晰直观展示病毒检测结果。

2019年底，武汉市出现因新型冠状病毒感染导致的肺炎疫情，截至2月15日上午，全国已有超过6.6万人感染，并造成超过1500人死亡。

疫情爆发初期，用于确诊的real-time PCR检测试剂盒供应不足，导致许多疑似病例迟迟不能确诊。

近期检测试剂盒供应量上来后，不少案例发现，试剂盒检测为阴性的，实际已经感染新冠病毒，而且，real-time PCR检测耗时长、操作复杂，难以满足快速增长的疑似病例排查需求。

对于武汉此次爆发的急性病毒性疫情来说，检测试剂盒的灵敏性、检测速度、价格、操作简便性等缺一不可。

SHERLOCK技术的发明

CRISPR/Cas系统是细菌和古菌特有的免疫系统，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时，该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA，然后 CRISPR 相关蛋白（Cas，一种核酸内切酶）在序列识别处切割外源基因组DNA，从而达到防御目的。

CRISPR技术是在20世纪90年代初发现的，2013年2月15日，张锋等人将CRISPR/Cas9系统成功应用于哺乳动物和人类细胞的基因编辑，此后迅速成为人类生物学、农业和微生物学等领域最流行的基因编辑工具。

根据效应核酸酶组成的亚基数量，CRISPR/Cas系统可以分为两类：第一类系统的核酸酶由多个亚基组成；第二类系统特别受关注，其核酸酶由单一的蛋白组成，包括基于Cas9、Cas12和Cas13效应蛋白的II、V和VI型。其中，与大多数Cas蛋白不同，Ⅵ型系统的核酸酶Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶，专一的切割RNA，不切割DNA，在分子诊断方面具有重要的应用价值。

世界上许多最常见或致命的人类病原体都是RNA病毒（例如埃博拉病毒，寨卡病毒，艾滋病病毒，流感病毒等）此次在武汉爆发的新型冠状病毒，同样是RNA病毒。

2017年4月，CRISPR基因编辑大牛张锋，在Science杂志发表论文，发明了基于CRISPR/Cas13的病毒检测技术。

张锋将这种检测技术命名为——SHERLOCK，这一与神探夏洛克·福尔摩斯同名的检测技术，可以让被切割的RNA形成条带，形成视觉可见的线索，并直观展示出来。

SHERLOCK（specifichigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking）

相比于传统的real-time PCR检测，SHERLOCK检测技术准确度更高，而且价格和检测所需时间也减少了一半。

张锋，CRISPR领域的奠基人之一，最早将CRISPR应用于哺乳动物和人类细胞

SHERLOCK大显身手

2018年，非洲尼日利亚爆发拉沙病毒，张锋所在的Broad研究所与尼日尼亚展开合作，使用SHERLOCK检测技术检测拉沙病毒。由于尼日利亚经常发生断电，而聚合酶链式反应（PCR）检测对电力依赖强，而SHERLOCK对于断电不像PCR对断电那么敏感，再加上SHERLOCK成本更低，时间更快，大大提高了病毒检测效率。据估计，SHERLOCK检测技术的应用，帮助减少了对尼日利亚拉沙病毒60%的死亡率。

Jennifer Doudna：CRISPR领域的奠基人之一

此外，CRISPR基因编辑奠基人Jennifer Doudna和她在伯克利的团队也开发了基于CRISPR/Cas12a的检测技术，用于检测人乳头瘤病毒（HPV）病毒。Jennifer Doudna希望这一检测工具能够帮助遏制宫颈癌死亡人数的上升，对于发展中国家和非洲等地的国家，疾病通常被诊断发现时已经太晚。

南美洲国家洪都拉斯和美国加州的科学家正在测试针对登革热病毒、寨卡病毒和与癌症相关的人乳头瘤病毒（HPV）毒株的CRISPR检测诊断。

2018年，非洲刚果民主共和国爆发新的埃博拉疫情，张锋的同事、SHERLOCK检测技术的负责人、Broad研究所研究员Pardis Sabeti第一时间对来自感染者的病毒样本进行了测序，从DNA数据中清楚确定了病毒传播的途径。参与这项工作的许多科学家在这次疫情中感染死亡，但换回了更多生命。而此前，她就因为在埃博拉疫情中的贡献被评为《时代周刊》2014年度人物，当之无愧的“埃博拉斗士”。

非洲刚果民主共和国也正在进行一项针对埃博拉病毒的CRISPR检测的探索性研究。

特别值得一提的是，Jennifer Doudna团队和张锋团队之间虽然正在进行的激烈的专利争夺战。但双方均表示，他们致力于授权CRISPR检测工具，以便需要这些诊断的人可以使用它们。

SHERLOCK还能消灭病毒

2019年10月10日，麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的Pardis C. Sabeti、张锋等人在Cell子刊Molecular Cell杂志发表了题为：Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13 的研究论文。

Parson Sabeti、张锋等将Cas13的抗病毒活性与其诊断能力结合起来，建立了一个强大和快速可编程的诊断和抗病毒系统，命名为CARVER(Cas13辅助的病毒表达和读出限制)，以检测和消灭人类细胞中基于RNA的病毒。该系统将来可能用于诊断和治疗病毒感染(包括由新病毒和新兴病毒引起的感染)。

注：CARVER，Cas13-assistedrestriction ofviralexpression andreadout，同时，CARVER也有雕刻师的意思。

研究人员通过实验测试了Cas13在分别感染了三种不同RNA病毒的人类细胞中的活性：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、甲型流感病毒(IAV)和疱疹性口炎病毒(VSV)。研究人员将Cas13基因片段和一种工程化的引导RNA导入细胞，24小时后，将细胞暴露在病毒中。再过24小时后，Cas13酶使细胞培养中的病毒RNA水平降低了多达40倍。

研究小组进一步研究了Cas13对病毒感染性的影响——换句话说，剩余的病毒有多少可以继续感染人类细胞。数据表明，在病毒暴露8小时后，Cas13将流感病毒的传染性降低了300多倍。

为了增加诊断需求，研究人员还采用了基于Cas13的核酸检测技术SHERLOCK（specifichigh-sensitivityenzymaticreporter unlocking）。这个三合一的CARVER系统可以快速测量样品中病毒RNA的剩余水平。

这项研究表明，基于CRISPR/Cas13的基因编辑工具，不仅能用于病毒的快速检测诊断，还能用于清除病毒，治疗病毒引起的疾病。

国内相关研究情况

2018年3月12日，中科院上海植物生理生态研究所王金博士等在Cell Research杂志上发表了题为：CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA 的研究论文。

该研究深入系统地研究了Cas12a对于靶标ssDNA和非靶标ssDNA的切割特性。表明Cas12a可用于对单链DNA病毒的快速检测。

值得一提的是，该研究论文投稿时间比Jennifer Doudna团队的类似研究论文投稿时间更早，这也说明我国在CRISPR领域已经达到国际领先水平。

结语

对于大多数传染病来说，诊断需要专业的知识，先进的设备和充足的电力 ，而这些要求在许多爆发疫情的地方都达不到。

对于快速爆发的病毒性疫情，快速检测和确诊现得尤为重要，早一分一秒，就意味着更早一些控制疫情蔓延，减少人员伤亡。

目前正在使用的real-time PCR检测技术虽然在新冠病例确诊和疑似病例排查中发挥了重要作用，但是受操作复杂、耗时长、需集中送检等限制，不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者的排查诊断需求。

基于CRISPR的病毒检测工具提供了与传统方法一样、甚至更高的诊断准确率，并且非常简单易操作，检测所需时间也缩短一半。

参考内容：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.09.013

https://doi.org/10.1126/science.aam9321

https://doi.org/10.1038/s41422-018-0022-x

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