真核藻类和有胚植物(苔藓、蕨类和种子植物)中的叶绿体，均起源于大约15亿年前的一次内共生事件：蓝细菌被异养原生生物吞入后逐渐演化为共生。在演化过程中，蓝细菌基因组中的数千基因被删除或转移至宿主的核基因组；如今，真核光合自养生物的叶绿体基因组仅编码100-250个基因，排布在环状闭合的双链DNA上。尽管如此，叶绿体基因组却编码了植物部分最重要、丰度最高的蛋白，如光合作用复合体、二磷酸核酮糖羧化酶等【1】。
基因枪和同源重组技术的发展，使得对叶绿体基因组的编辑成为可能。叶绿体转化最早在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中实现，随后在烟草（ Nicotiana tabacum）中也获得成功。如今，在地钱、大豆、土豆等植物中也报道了叶绿体转化的方法，但对莱茵衣藻和烟草的叶绿体转化仍是最成熟的【1】。今年2月，Ralph Bock教授课题组报道了针对模式植物拟南芥的高效质体转化方法，并成功获得可育的转化植株【2】，一时引发了热烈讨论（点击查看：叶绿体高效遗传转化技术体系建立，为基因工程带来新的活力）。
叶绿体转化技术打开了系统探究叶绿体基因组功能的大门。同时，由于在叶绿体中表达外源蛋白具有诸多优势（如精准编辑、规避表观修饰介导的基因沉默、转入人工操纵子、表达量高等），叶绿体转基因植物更有潜力被用于代谢工程、用作“蛋白工厂”（如生产疫苗、酶）等【1】。然而在叶绿体中大量表达外源基因、常妨碍植物自身生长发育，基本的解决办法是使用诱导表达。在烟草中，此前已报道的诱导系统有：lac系统、T7 RNA 聚合酶系统、sigma因子系统等，其中效果相对最好的方法——使用茶碱诱导的核糖开关激活T7 RNA 聚合酶表达，目标蛋白的变化幅度也只有7倍、最高蛋白产量仅为叶片总蛋白的约1.75%【3】。
近年来研究表明，植物核基因组编码的PPR蛋白（pentatricopeptide repeat proteins）能激活叶绿体基因的表达。PPR蛋白包含多个串联重复的结构域，每个结构域有31~36个氨基酸残基，其大部分成员定位在叶绿体或线粒体中，通过结合特定的RNA序列参与调控细胞器中基因表达的各个阶段【4】。研究表明可以改造PPR蛋白的关键识别基序、来使PPR蛋白靶向特定的RNA序列【5】。
基于以上背景，来自美国俄勒冈大学（University of Oregon）的Alice Barkan教授课题组设计了一套全新的PPR10*–atpH叶绿体转基因的诱导表达系统，相关成果以 Engineered PPR proteins as inducible switches to activate the expression of chloroplast transgenes 为题发表在Nature Plants期刊上。该系统包含两个关键组分：1）可诱导的/组织特异的启动子+改造的PPR10* 2) PPR10*的识别序列+需要在叶绿体中表达的外源基因。
研究者选择了研究较透彻的玉米PPR10蛋白：PPR10由核基因组编码、带有进入叶绿体的导肽，它识别并结合叶绿体基因atpH的RNA上游一段20bp的序列，结合后可以阻碍5′→3′ 核糖核酸外切酶降解该RNA，并能增强翻译效率，由此提高atpH基因的表达水平。之前的核糖体印记分析表明，PPR10缺失后、atpH的表达降低了70倍。另一方面，atpH的mRNA也是玉米幼苗的叶片内翻译效率最高的蛋白。
烟草是质体转化技术最成熟的种子植物，但其基因组中也编码大量的PPR蛋白。为减少本底表达，研究者对玉米PPR10的关键识别基序进行定点突变，获得突变后的PPR10*：PPR10*识别新的RNA序列，该序列预测（几乎）不会被烟草自身编码的PPR蛋白识别。因此，在PPR10*不表达时，外源转入基因的RNA不能被烟草的PPR识别、表达量极低；当PPR10*表达时，PPR10*进入叶绿体、特异地结合到预测的识别序列上，极大促进位于该识别序列下游的外源基因表达。
图 实验策略
为验证该策略的可行性，研究者测试了两种PPR10*（PPR10GG 和 PPR10AA），分别用它们诱导位于 ‘GG site’ 和 ‘AA site’下游的报告基因(GFP)表达。其中诱导型启动子接PPR10*转入一组烟草的核基因组， GG site /AA site接报告基因转入另一组烟草的叶绿体(使用aadA筛选标记)，通过杂交获得双转的植株。验证结果表明：
1）报告基因的表达量和PPR10GG的表达量呈正相关；
2）PPR10GG仅激活 GG site下游基因的表达，而不激活 AA site下游基因的表达，反之亦然；
3）使用乙醇诱导表达PPR10GG，可使相应报告基因的表达上升20倍，丰度达可溶性蛋白总量的15%。
4）RNA印迹杂交显示：PPR10GG可以稳定报告基因的mRNA。
综上，文章作者使用“改造的PPR蛋白”和对应的“新识别位点”，实现了在翻译水平调控转入叶绿体的外源基因的表达。外源基因的表达量与PPR*的表达量成倍数关系，且可变范围非常大（在PPR10*表达量最高的株系中，报告基因的丰度，较无PPR10*时上升超过40倍、蛋白量达到可溶性蛋白总量的25%，且还有上升潜力）。这既是精细调控转叶绿体基因的表达水平的有力工具，更为叶绿体基因组的研究和应用开辟了新可能。
参考文献：
【1】Bock, R. Engineering plastid genomes: methods, tools, and applications in basic research and biotechnology. Annu. Rev. Plant Biol. 66, 211–241 (2015).
【2】Ruf, S., Forner, J,. Hasse, C., Kroop, X., Seeger, S., Schollbach, L., Schadach A. & Bock, R. High-efficiency generation of fertile transplastomic Arabidopsis plants. Nature Plants 5, 282–289 (2019).
【3】Emadpour, M., Karcher, D. & Bock, R. Boosting riboswitch efficiency by RNA amplification. Nucleic Acids Res. 43, e66 (2015).
【4】Barkan, A. & Small, I. Pentatricopeptide repeat proteins in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 65, 415–442 (2014).
【5】Kindgren, P., Yap, A., Bond, C. S. & Small, I. Predictable alteration of sequence recognition by RNA editing factors from Arabidopsis. Plant Cell 27, 403–416 (2015).
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