案例分析
上周科技君介绍了混合测序那些必须要绕过的“坑”。那么混合测序到底适用于什么样的群体？如何进行研究更有效？混合DNA测序如何定位突变位点？混合DNA、RNA测序如何进行基因定位？混合测序可以进行GWAS研究或驯化研究吗？
今天和大家分享这些经典案例，说不定能解答您的疑问，帮助打开新的研究思路。
点突变检测
对于突变位点，特别是隐性纯合的点突变，利用混合样本测序研究效果比较好。日本一个研究水稻的实验室，针对点突变检测设计了一系列的检测方法和软件。
图1 点突变检测方法MutMap[1]、MutMap+[2]、MutMap-Gap[3]
01
MutMap
水稻品种Hitomebore的突变体（叶子浅绿色）Hit1917-pl1和Hit0813-pl2与野生型杂交，构建了大于200个的F2群体中，选择20个具突变表型子代混合测序。在突变体Hit1917-pl1和Hit0813-pl2分别检测到1,001和1,339个G→A/C→T的突变位点；Hit1917-pl1在10号染色体检测到一个包含7个SNP的集合，一个SNP位于基因OsCAO1的编码区，使得植株叶绿素含量降低；Hit0813-pl2在1号染色体体检测到一个包含5个SNP的集合。
02
MutMap+
用化学诱变剂EMS对水稻受精后幼年胚芽进行诱变，诱变后产生的M1（突变位点为杂合位点）。M1自交获得M2，目标突变性状是由一个隐性基因控制的，在M2代出现性状分离；选择杂合突变基因型的M2自交，获得M3；M3发生性状分离，选择M3子代中野生型和突变型各20-40株个体，混池测序。测序reads比对到亲本基因组上，计算SNP-index。M3突变混合池中目标突变位点SNP-index=1，同时通过比较突变池和野生池的SNP-index差值，计算△SNP-index，利用Fisher精确检验判断候选区间，检测突变所在的基因区域。
03
MutMap-Gap
利用MutMap可以检测点突变，但是如果目标位点位于参考基因组没有组装上的gap区，或是参考基因组不具有的序列中，那么利用MutMap检测方法则不能有效检测到目标突变位点。MutMap-Gap方法结合了MutMap和de novo组装，首先将所要研究的样本进行MutMap分析，通过计算SNP-index，分析SNP-index peak区，发现找不到跟突变性状相关的基因；那么突变位点很有可能就在品系特有基因区域内，将之前比对不上参考基因组的野生型亲本unmapped reads和MutMap分析中SNP-index peak区域的野生型亲本比对上的reads一起进行de novo组装，获得潜在的新基因，并以此为参考再计算SNP-index，检测目标突变位点。
作图群体混合分组分析（BSA）
棉花突变体T582是由棉花品种TM-1突变获得，它与TM-1有5种突变表型不同，包括V1-黄叶、cu-上曲叶、gl1-茎与圆荚无气封、fg-窄苞叶、cl1-双胞圆荚。T582与TM-1杂交，F1与T582回交构建BC群体，根据5种突变表型选择突变表型样本28个进行混合测序。T582测序37.9X、混合样本测序7.2-13.8X。T582 测序reads比对回TM-1 参考基因组，检测双亲间的SNP，突变表型混合样本测序reads比对回参考基因组 TM-1计算SNP频率，筛查只含有 mutant-type SNPs的区域。
图2 BSA分析定位棉花突变位点[4]
混合样本GWAS分析
从意大利和澳大利亚收集到3万个野生果蝇，分成5份，意大利3份，澳大利亚2份，在实验室环境下繁殖一代，检测8000个雌性果蝇腹部颜色，然后5个重复中各取100个黒腹和100个浅色腹部的样本混合测序，检测部位为A7背片。Pool-GWAS检测到17个SNP（FDR<5%）与雌性的腹部颜色相关。这些SNP位于已知的影响色素沉积基因tan和bab1的附近。但是检测的SNP没有位于基因编码区内的，而是位于基因tan和bab1顺式调控区域。上面是利用5个重复的群体获得的结果，如果分别用100vs100的样本分析检测功效降低很多，只有几个显著性关联位点。但是在本研究中作者也提到Pool –GWAS 研究复杂遗传背景的性状功效降低，对稀有变异的检测能力下降。
图3 果蝇混合样本GWAS分析[5]
混合样本研究驯化
家鸡的现代野生型祖先和 8个品系的家鸡，每个品系选择8-10个个体进行pooling测序，平均每个个体0.5X；利用驯化相关区域杂合度降低，及与祖先红原鸡遗传距离增加的特点，在家鸡的基因组上分析筛选出蛋鸡驯化的关键基因 (TSHR)；用同样的方法，找到肉鸡驯化的关键基因。但是我们也可以看到这样分析获得的驯化相关位点很多，如果想用类似的方法检测复杂性状相关位点，后续挖掘真正的功能位点的难度还是很大。
图4 鸡混合样本研究驯化[6]
上面提到的都是DNA层面的混合测序，那么利用RNA混合测序可以进行类似的研究吗？
Pooled RNA测算等位基因频率，准吗？
Pooled RNA-seq区别于DNA pool-seq测序，RNA在不同的样本间、不同的基因位点、同一基因不同等位基因间的表达量都可能不同。从图5研究的结果可见混合RNA测序比单独RNA测序检测的SNP数量大幅下降，高质量SNP中只有26.8%在Pool-seq中被检测到，并且大部分是MAF>0.25。混合样本测序对于MAF小的SNP等位基因频率预估错误率比较高，但随着MAF增大，错误率降低。样本间基因表达水平的差异会影响等位基因频率检测。但是基因表达水平检测结果与混合与否差距不大。所以对于非稀有SNP，利用Pool RNA-seq检测等位基因频率也是可行的，并且同时可以研究基因表达差异。但是相对而言RNA测序检测的SNP数量低，而且只适用于高频的SNP，应用的限制性更高，非必要的情况下还是优先选择DNA测序。
图5 混合RNA测序计算等位基因频率评估结果[7]
小麦RNA pooling测序BSR分析
小麦条锈病高抗品种和高感品种杂交构建RIL群体，筛选高抗和高感各40株小麦混合，转录组测序进行BSR（bulked segregant RNA-seq）分析。在4B染色体长臂上检测到12个SNP与抗性有关联。然后筛选4BL上的DNA标记进行BSA分析，验证了分析结果。但是RNA测序只能检测表达基因上的SNP，比DNA层面的变异少，同时由于存在RNA编辑等问题，RNA层面检测的SNP和DNA层面也是有差别的，所以只有DNA层面无法实现，或DNA测序成本过高（如超大基因组），可以选择BSR，否则还是更推荐BSA。
图6 小麦BSR分析定位条锈病抗性基因[8]
什么研究推荐样本混合测序？
参考文献：
[1] Abe A, Kosugi S, Yoshida K, et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap[J]. Nature biotechnology, 2012, 30(2): 174.
[2] Fekih R, Takagi H, Tamiru M, et al. MutMap+: genetic mapping and mutant identification without crossing in rice[J]. PloS one, 2013, 8(7): e68529.
[3] Takagi H, Uemura A, Yaegashi H, et al. MutMap‐Gap: whole‐genome resequencing of mutant F2 progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii[J]. New Phytologist, 2013, 200(1): 276-283.
[4] Zhu J, Chen J, Gao F, et al. Rapid mapping and cloning of the virescent-1 gene in cotton by bulked segregant analysis–next generation sequencing and virus-induced gene silencing strategies[J]. Journal of experimental botany, 2017, 68(15): 4125-4135.
[5] Bastide H, Betancourt A, Nolte V, et al. A genome-wide, fine-scale map of natural pigmentation variation in Drosophila melanogaster[J]. PLoS genetics, 2013, 9(6): e1003534.
[6] Rubin C J, Zody M C, Eriksson J, et al. Whole-genome resequencing reveals loci under selection during chicken domestication[J]. Nature, 2010, 464(7288): 587.
[7] Konczal M, Koteja P, Stuglik M T, et al. Accuracy of allele frequency estimation using pooled RNA‐Seq[J]. Molecular ecology resources, 2014, 14(2): 381-392.
[8] Wang Y, Xie J, Zhang H, et al. Mapping stripe rust resistance gene YrZH22 in Chinese wheat cultivar Zhoumai 22 by bulked segregant RNA-Seq (BSR-Seq) and comparative genomics analyses[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2017, 130(10): 2191-2201.
撰稿：小 萍
编辑：市场部
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